基于谱效关系的外感风痧颗粒Q-Marker研究.docx

基于谱效关系的外感风疹颗粒Q-Marker研究刘雯，覃慧杰，何婷，覃;吉萍,冯旭(广西中医药大学药学院,广西南宁530200)摘要目的:研究外感风筋颗粒指纹图谱与其体外抗炎作用的相关性»方法:建立外感风筋颗粒的高效液相指纹图谱；采用脂多糖刺激小鼠巨蹴8胞RAW264.7模型，检测外感风的颗粒对一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-C(TNF-C)、白细胞介素6(IL-6)释放的影响，考察其抗炎活性；采用灰色关联度法和偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)分析外感风版颗粒指纹图谱共有峰与其抗炎药效之间的谱效关系。结果:通过外感风的颗粒HPLC指纹图谱分析，共确定了24个共有峰.灰色关联度分析结果显示，24个共有峰对药效贡献均较大；偏最小二乘判别法分析结果显示除峰3和峰16外，其他22个共有峰对抗炎药效贡献均较大，说明外感风防颗粒体外抗炎作用是多组分协同作用的结果.结论:建立了外感风痛颗粒的指纹图谱及其体外抗炎活性的谱-效关系，为该药的Q-Marker研究提供参考。关键词外感风族颗粒；HPLC图谱；谱-效关系;灰色关联分析；Q-Marker中图分类号R286文献码A(文蠲号1001-5213(2023)17-1920-06DOk10.13286/j.1001-5213.2023.17.06StudyonQ-MarkerofWaiganFengshaGranulesbasedonspectrum-activityrelationships1.IUwenQINHuijieHETingQINJieping>FENGXu(CollegeofPharmacyrGuangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,GuangxiNanning530200,China)ABSTRACT:OBJECTIVETostudythespectrum-activityrelationshipsofanti-inflammatoryactivitiesforwaiganFengshaGranules.METHODSHPLCchromatogramofwaiganFengshaGranuleswasestablished.TheRAw264.7modelofmousemacrophageswasstimulatedbylipopolysaharidetodetecttheeffectsofwaiganFengshaGranulesonthereleaseofnitricoxide(NO),tumornecrosisfactor-C(TNF-C)andinterleukin-6(IL-6),soastoinvestigatetheanti-inflammatoryactivities；thegreyrrelationanalysisandPLS-DAwereusedtoanalyzethecorrelationofthespectrumpeaksandthepharmalogicalactivitiesindifferentsamples.RESULTSAtotalof24commonpeakswereidentifiedbyHPLCfingerprintanalysisforwaiganFengshaGranules.Theresultsofgreycorrelationanalysisshowedthatthecontributionof24commonpeakstoanti-inflammatoryactivitieswassignificant.andtheresultsofPLS-DAshowedthatthentributionoftheother22commonpeakstoanti-inflammatoryactivitieswassignificantexceptPeak3andPeak16Theresultsshowedthattheanti-inflammatoryeffectsofwaiganFengshagranulesin心itroweretheresultsofmulti-componentsynergisticactions.CONCLUSIONThespectrum-activityrelationshipsofHPLCchromatogramandanti-inflammatoryeffectsz7,ffowereestablished，whichprovidereferenceforthefurtherstudyonQ-Marker.KEYWORDS:waiganFengshaGranules；HPLCchromatogram；spectrum-activityrelationship;greyrelationalanalysis；Q-Marker基金项目广西自然科学基金项目（编号:2020GXNSFBA297135）;广西高校中药提取纯化与质量分析重点实验室项目（编号:桂教科研 （20146 ）作者简介刘雯，女，博士,副教授，研究方向:中药活性成分及质量控制通信作者冯旭，男，硕士,教授，研究方向:中药活性成 分及质量控制外感风物颗粒为国家颁布标准品种、广西传统特色优势壮药，是广西中医药大学百年乐制药厂的特色品种，组方源自壮族民间验方，由苍耳草、狗仔花、藤苦参、山芝麻、岗梅、两面针6味药材配方而成，具有祛风、清热之功效，临床主要用于风热感冒、咽喉肿痛等的治疗。现代药理研究表明，外感风族组方有明显抗菌、退热、镇痛、抗炎、增强免疫功能等作用0°外感风的颗粒临床应用效果较好，具有较大的开发利用前景。目前关于外感风疹颗粒相关研究较少，仅有少数学者对其制剂工艺序切和质量控制网进行了研究o课题组对其质量控制也进行了相关研究U，建立了HPLC同时测定外感风眇硒中9种物质（原儿茶酸、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C）的方法，为其质量控制、临床应用提供了参考。关于中药质量控制的指标物质，刘昌孝院士网于2016年提出了中药质量标志物（Q-Mark-er）的概念，指出指标性成分要与药效相关0目前关于外感风眇颗粒Q-Marker的研究仍属空白，课题组前期研究中的9个组分是否是外感风防颗粒发挥药效的主要成分,是否可以作为Q-Marker,尚未明确,有待进一步研究。谱效关系研究能够表征中药化学成分-药效相关关系，可以较为快捷地从复杂体系中筛选活性化合物”。，不失为一种初步探索中药药效成分的优良方法。本实验采集了外感风疹颗粒的HPLC图谱，考察了外感风疹颗粒的体外抗炎活性，通过灰色相关分析和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）研究外感风筋颗粒HPLC指纹图谱和体外抗炎活性之间的关联性，探讨外感风疹颗粒发挥抗炎作用物质基础，以期为外感风版颗粒Q-Marker的确定提供实验依据。1材料1. 1仪器AgiIentI260型高效液相色谱仪，四元泵，柱温箱，可变波长检测器（美国AgilentTech-nologies公司）;SQP十万分之一电子分析天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）,MultiskanSky全波长酶标仪（美国ThermoFisherSCientifiC公司）；CO2培养箱（上海普和希健康医疗器械有限公司）；CKX41SF显微镜（日本OIymPUS公司）;SW-CJ-ID单人单面净化工作台（苏州智净净化设备有限公司）;ST16系列台式高性能离心机（美国ThermoFisherSCiemifiC公司）。1.2试药胎牛血清（四季青）QMEM培养基（GIBCO）;MTT、脂多糖、GreSS试剂（Sigma）;TNF-CELISA检测试齐!J盒（伊莱瑞特生物科技有限公司，批号7UFSNXIJQU）/L6ELISA检测试齐IJ盒（欣博盛生物科技有限公司，批号M220517-004a）。水为纯化水，甲醇、磷酸乙醇为分析纯，乙睛为色谱纯，1,3-二咖啡酰奎宁酸、隐绿原酸、迷迭香酸、丁香酸、异绿原酸B、木犀草甘、原儿茶酸、绿原酸、原儿茶醛、橙皮昔、异绿原酸C、异绿原酸A、新绿原酸、咖啡酸对照品均购自成都麦德生科技有限公司（批号分别为：RP20021kRP200726、RP190718RP191215×RP220619、RP210521、RP190605RP210505、RP190629、RP220321×RP2010226xRP220616、RP200416、RP220610,纯度>98.0%）。外感风族颗粒共10批，其中1批购自南宁市药店（批号20201101,编号Sl）,9批实验室自制（编号S2-S10）。狗仔花、苍耳草、岗梅、藤苦参、山芝麻、两面针均购自玉林药材批发市场，经广西中医药大学药学院中药鉴定教研室谭勇教授鉴定分别为菊科斑鸠菊属植物融下花VernOniaPatUIa（Dryand.）Merr.的全草、菊科苍耳属植物苍耳XantHiumSibiricumPatr.PatrinexWidder的全草、冬青科冬青属植物梅叶冬青ITasprella（Hook.EtArm.）cHamp.exBenth.的干燥根及根茎、萝商斗马莲鞍属植物马莲鞍StreptocaulongriffitHiiHook.f.的干燥根茎、梧桐科山芝麻属植物山芝麻HelicteresangustifoliaL.的干燥根和芸香科花椒属植物两面针zantHoT>Iumnitidum（Roxb.）DC.的干燥根。以上药材各购买了5批，经检测均符合相关标准要求，用于实验室自制外感风族颗粒。1. 3细胞株RAW264.7小鼠单核巨噬细胞株由广西中医药大学药理教研室杨柯教授赠予。2方法与结果2. 1外感风瘀颗粒HPLC指纹图谱的建立2. 1.1色谱条件色谱柱：依利特HypersilC18（4.6mmx250mm,5m）；流动相：乙睛-0.2%磷酸，梯度洗脱（05min,乙睛8%;510min,乙睛8%10%;1023min,乙睛10%11%;23-28min,乙睛11%17%;2832min,乙睛17%一18%;3240min,乙睛18%20%;4045min,乙三20%24%;45-55min,乙睛24%32%；5565min,乙揩32%70%;65-70min,乙腾70%）；流速:ImLmin1；柱温：30节；进样量:10L转换波长条件:0-6min,330nm;6-10.3min,275nm;10.312.7min,330nm；12.7T7min,275nm;1722.5min，330nm;22.526min，275nm；2646.5min,330nm；46.547.7min,275nm；47.7-70min，33Onm。2. 1.2溶液制备（1）混合对照品溶液：分另嵋密称取原儿茶酸、新绿原酸、原儿茶醛、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、丁香酸、1,3-二咖用酒隆宁酸、异绿原酸B、异绿原酸A、橙皮甘、急原酸C、迷迭香酸适量,加甲醇溶解，配制成一定浓度的对照品储备液。精密称取木犀草首适量，加70%乙醇溶解，配制成一定浓度的对照品储备液。精密移取各储备液适量至同一量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，配制成含原儿茶酸O.02937mg.mL新绿原酸0.07535mg.mL原儿茶醛O.01478mg.mL绿原酸O.07695mg.mL隐绿原酸0.07322mg.mL咖啡酸0.006822mg.mL丁香酸0.004960mg.mL1,3-二咖啡酰奎宁酸O.06104mg.mL木犀草首O.01598mg.mL异绿原酸BO.1226mg.mL异绿原酸A0.04236mg.mL橙皮昔O.02894mg.mL异绿原酸CO.1190mg.mL迷迭香酸O.05042mg.mL