中国旱獭Ⅰ型干扰素受体β亚基克隆、表达及功能初步鉴定.docx
病毒性肝炎DOI：10.12449ZJCH240210中国旱獭I型干扰素受体B亚基克隆、表达及功能初步鉴定陶颖】，杨东亮2,王宝菊2,刘艺L桂文甲李智】，樊和斌】1中国人民解放军中部战区总医院感染科，武汉4300302华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科，武汉430030遹言储：绮QM,296592559(ORQD:0000-02-9602-7755)摘要：目的克隆中国旱獭I型干扰素受体亚基(mhIFNAR2)的基因，并进行抗体制备及功能鉴定。方法应用RrPCR技术，从中国旱獭脾组织中扩增得到序列，克隆至原核表达载体pRSET-B,表达重组蛋白，电泳和WesternBlot法鉴定;重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠制备其胞外段多克隆抗体，免疫组化、免酸光和WesternBlot法鉴定;再通过siRNA阻断的方法检测其功能。计量资料多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-检验.结果从mhIFNAR2扩增出1491300bp片段，其同源性在分析的种属中以土拨鼠最高,可达98.05%.成功地构建了表达胞外段mhIFNAR2(50813a)蛋白的原核表达质粒，命名为pRSET-B.mhIFNAR2;其表达重组蛋白分子量27kD,纯化后纯度约为95%,浓度约为160gmL用纯化的重组蛋白常规免疫BALB/c小鼠后，获得1:1000的特异性多克隆抗体，用免疫组化及免疫荧光可见细胞膜、细胞质有表达。合成的三条siRNA,其中有一条起始于277位点的siRNA(siRNA277)与空白对照及阴性对照相比，可以沉默目的基因的表达，并能减干扰素的信号通路(P值均005)0结论获得mhIFNAR2的部分序列，成功地制备出抗mhIFNAR2胞外段多克隆抗体，该抗体有较高的效价和特异性，并能用于免疫组化、免疫荧光及WesternBlot的检测.用siRNA277可以抑制目的基因的表达，并能阻断干扰素的信号通路。关键词：受体，干扰素a。；克隆；乙型肝炎基金项目：国家自然科学基金(3021170);国家重大基础研究项目(973)(2005CB522900)Preliminaryidentificationofthecloning,expression,andfunctionofMarmotahimalayanatypeIinterferonreceptorsubunitTAOYing1,YANGDonglianlWANGBaojif,UUYi11GUIVVenjia1,LIZhi,FANHebin1.(1.DepartmentOflnfectiousDiseases,GeneralHospitalofTheCentralTheaterCommand,Wuhan430030,China;2.DepartmentofInfectiousDiseases,UnionHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeOfHuazhongUniversityOfScienceandTechnology,Wuhan430030,China)Correspondingauthor:FANHebin,296592559qq.8m(ORCID:0000-0002-9602-7755)Abstract:ObjectiveTodonethegeneofManrnotahimalayanatypeIinterferonreceptorsubunit(mhIFNAR2),andtoperformantibodypreparationandfunctionalidentification.MethodsRT-PCRwasusedforamplificationinthespleentissueofMarmotahimalayanatoobtaintesequence,whichwasclonedtotheprokaryoticexpressionvectorpRSET-Btoexpresstherecombinantprotein.ElectrophoresisandWesternblotwereusedforidentification.BALB/tmicewereimmunizedwiththerecombinantproteintopreparethepolyclonalantibodyofitsextracellulardomain;immunohistochemisby,immufluoresoenceassay,andWesternBlotwereusedforidentification,andthemethodofsiRNAblockadewasusedtoinvestigateitsfunction.Ananalysisfvariancewasusedforcomparisdcontinuousdatabetweenmultiplegroups,andtheleastsignificantdifferenceAtestwasusedforcomparisonbetweentwogroups.ResultsAfragmentofmhIFNAR2(1491300bp)wasobtainedfromspleentissue,whichshewedthehighesthomologyof98.05%inmarmotAprokaryoticexpressionplasmidwassuccessfullyconstructedforexpnessioftheextracellulardomainofthemhFNAR2(三)andwasnamedpRSET-BmhIFNAR2,andtherecombinantproteinexpressedbythisplasmidhadaFnolecularweightof27kD,apurityofabout95%afterpurification,andaConCentrationof160gmLAfterBALB/cmicewereimmunizedwiththepurifiedrecombinantprotein,1:1000specificpdydonalantibodieswereobtained,andimrnunohistochernistjyandimmunofluorescenceassayshowedtheexpressionincellmembraneandcytoplasm.AmongtethreesiRNAssynthesizedzthesiRNAstartingfromte277locus(siRNA277)couldSienCetheexpressionoftargetgenesandweakentheinterferonSignaingpathwaycomparedwiththeblankcontrolgroupandthenegativecontrolgroup(bothP<0.05).CondusionThefragmentofmhIFNAR2isobtainedzandthepolyclonalantibodyfortheextracellulardomainofmhIFNAR2issuccessfullyprepared,withrelativelyhightiterandspecificity,andcanbeusedforimmuhistochemisty,immunofluorescenceassay,andWesternblotKeywords:Receptor,Interferonalpha-beta;Gone;HepatitisBResearchfunding:NationalNaturalScienceFoundationofChina(3021170);NationalMorBasicResearchProjects(973)(25CB522900)干扰素共用I型受体，该受体有a、两个亚单位，分别称为IFNARl和IFNAR2(141o中国旱獭是研究HBV感染的重要动物模型6。本研究对中国旱獭I型(marmatahimalayanatypeIinterferonreceptorsubunit,mhIFNAR2)进行、三lM体制备，并在体外用SiRNA鉴定其功能，为研究干扰素抗土拨鼠肝炎病毒的确切机制、土拨鼠肝炎病毒持续感染的原因及提高干扰素的疗效奠定基础。1材料与方法1.1 材料HepG2细眼DH5.BHK细胞、脑C腑漏毒(encephalomyocardisvirus,EMCV)由同付属协和医院感染科实验室保存；WH12-6细胞由德国埃森大学陆蒙吉教授提供；pSUPER由美国Baylor大学细胞生物学系冯新华教授惠赠；引物和RNAi由上海英俊公司合成；限制性内切酶PStI、EcoRI、BglII和SalI、PMDI8T载体、DL2000、T4DNA连接酶、T4多核昔酸激酶购自Takara公司；TrizoLLipOfeCtamine2000购自Invitrogen公司；质粒抽提试剂盒为北京博大泰克生物基因技术有限公司生产；Taq酶和胶回收试剂盒为Tiangen公司产品；dNTP由上海麦飞公司愚共;DMEMHyClone公司提供；M-MLV逆转录酶、RNasin由美国PrOmega公司提供；小牛血清购自杭州四季青公司；凝胶成像分析系统购自美国UVP公司。根据其他哺乳动物干扰素受体的保守性设计引物，由上海英俊公司合成，其他哺乳动物在GenBank中的序列号分别为：鼠NM.010509,牛NM_174553,羊NMoOlOO9342,人NM_207弼(表1)。RT-PCR扩增目的基因mhIFNAR2(50481a。1.2 方法1.2.1mhIFNAR2的克隆根据其他哺乳动物干扰素受体的保守序列设计引物，克隆具体步骤见文献7。1.2.2I型干扰素受体亚基的表达及多克隆抗体的制备测定重组质粒pRSET-B.mhIFNAR2核酸序列；重组质粒pRSET-B.mhIFNAR2转化高效表达菌Rossetta(DE3)plysS;菌体总蛋白的WeStemBlot分析：转膜后表1干扰素受体B亚基的引物序列Table1PrimersequencesforinterferonreceptorsubunitmhIFNARl-2s5,-AGTACATAGAAGCTGAAG-3'396416mhIFNARl-2as5,-CTCTCAGACCAAAAAGATG-3,943963mhIFNAR2-ls5,-CCATCTATCATGGGAAA-3,149169mhIFNAR2-IaS5,-CTCTCAAAAACACAGAGTT-3'12811300用兔抗His-probe(H-15)作为一抗fHRP标记的羊抗兔IgG作为二抗进行WesternBlot检测目的蛋白的表达；融合蛋白的大量制备及纯化：取纯化蛋白液20L,加2×蛋白电泳上样缓冲液20L于管中，100。(:煮沸5minSDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化效果；检测蛋白纯度：将目的蛋白表达过程中的各个组分进行SDS-PAGE电泳，结果进行蛋白条带灰度扫描，并用GelworkIDadvancedV4.Ol软件分析。检测蛋白浓度:通常每次纯化的样本都要行SDS-PAGE检测纯化样本的纯度，高纯度的样本被收集起来，用标准的Bradford法(考马斯亮蓝G-250法)测定蛋白浓度，为下一步免疫动物作准备。以纯化的重组蛋白mhIFNAR2B(5o8W)为免疫原,每次取120g溶于1mLPBS中，再与等体积的氢氧化铝佐剂混合，按40g只的抗原剂量，分另
