《动植物油脂甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定》（征求意见稿）编制说明.docx

中华人民共和国粮食行业标准动植物油脂甘三酯分子2一位脂肪酸组分的测定（征求意见稿）编制说明标准起草组2024年01月动植物油脂甘三酯分子2一位脂肪酸组分的测定编制说明1 .工作简况（包括任务来源、协作单位、主要工作过程、标准主要起草人及其所做的工作等）1.1 任务来源（包括标准下达计划、标准计划项目调整、标准制修订的背景、必要性和重要性）1.1.1 标准下达计划（包括标准下达计划文件、标准名称、第一起草单位等）动植物油脂甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定国家标准的修订项目，是根据国家粮食与储备局粮油标准质量管理办公室2019年正式下达的工作任务,立项编号为20192931-T-449,第一起草单位为江南大学。1.1.2 标准计划项目调整（如有，请写明申请调整的具体内容、理由和依据等）无。1.1.3 标准修订的背景、必要性和重要性油脂是混脂肪酸甘三酯Ctriacylglycerols）的混和物，是自然界存在的三大重要物质之一。甘三酯占食用油成分95%以上。脂肪酸在甘三酯中的酰化位置分布对油脂的氧化稳定性、熔点、凝固点及其营养价值有着非常重要的影响。脂肪酸在甘油骨架上的酰化位置决定着脂肪酸在人体的生物利用率。在人体胃肠道的胰脂肪酶是消化甘三酯最主要的酶，能优先水解廿三酯上位于srl,3位的脂肪酸并以游离的形式被人体吸收，s2位脂肪酸则直接以单甘酯的形式被人体吸收，这些单甘酯在小肠上皮细胞重新转化为甘三酯并与脂蛋白结合，成为乳糜微粒，经淋巴系统传送到脂肪组织中贮存或到其他组织提供能量。在此过程中，大约有70%的sr2脂肪酸保留在原位。因此，甘三酯的脂肪酸酰化位置效应对于廿三酯的营养价值有重要意义。与之相关的研究工作也越来越受关注，目前国外市场上已经出现了商业化的具有不同用途的针对甘三酯含功能性sr2脂肪酸的产品。sn-1 位R,R'sn-2zRm,sn3位图1甘三酯结构示意图由于甘油骨架上可以结合的脂肪酸很多，导致甘三酯的种类十分庞大，且一般天然油脂中的甘三酯不仅物理化学性质非常接近，同时还存在大量的同分异体和位置异构体。采用一般的色谱方法分析难以得到甘三酯的结构信息。因此，油脂分析检测上通常采用脂肪用酶将纯化后的甘三酯水解成2-单甘酯，经薄层层析（TLC）分离，用气相色谱测定脂肪酸组分含量的方法得到油脂甘三酯sr2位脂肪酸组成的信息。现行国标GB/T24894-2010动植物油脂甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定等同采用ISO国际标准：ISO6800:1997的方法，即采用胰脂肪酶水解甘三酯产生2-单甘酯，由于胰脂肪酶活性的问题（对于短碳链脂肪酸和超长碳链脂肪酸的水解效果不佳），本方法只适用于熔点低于45C且含有碳链在12-18之间的脂肪酸组成的甘三酯，不适用于含有12个或更少碳原子的脂肪酸（如椰子油、棕枢I仁油、黄油）、含有20个或更高度不饱和脂肪酸（多于4个双键，如鱼油、藻油、海洋动物油），以及含有氧化官能团的油脂。因此，在现行标准下，一些动植物油脂如椰子油、棕桐仁油、黄油、鱼油、藻油、海洋动物油等尚没有检测甘三酯分子2-位脂肪酸组分的测定方法。1.2 协作单位（除第一起草单位外的其他主要起草单位）国家粮食和物资储备局科学研究院、河南工业大学、武汉轻工大学、丰益（上海）生物技术研发中心有限公司。1. 3主要工作过程（应包括标准起草阶段、征求意见阶段、审查阶段、报批阶段等）2019年1月，成立标准起草组，开展标准起草工作；2019年2月一2023年1月，完成标准征求意见稿。1.4标准主要起草人及其所做的工作等主要起草人为王兴国、韦伟、赵晨伟、金青哲、刘玉兰、何东平、薛雅琳、段章群、曹文明。王兴国负责标准大纲的制定及标准内容的编制。韦伟、赵晨伟、金青哲、刘玉兰、何东平、薛雅琳、段章群、曹文明负责标准内容的编制及相关数据收集及验证。2.标准编制原则和确定标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据）。修订标准时，应列出与原标准的主要差异和水平对比。2.1 本文件与GB/T24894-2010相比较的主要技术差异如下 更改了范围（见第一章，2010版的第一章）； 更改了部分试剂（见5.2,2010版的4.2）；更改了部分仪器（见6.2,2010版的5.2）； 更改了部分操作步骤（见9.4,2010版的8.4）； 更改了精密度（见第十一章，2010版的第十章）； 更改了实验报告（见第十二章，2010版的第十一章）； 删除了附录（见2010版的附录）； 删除了参考文献（见2010版的参考文献）；2.2主要修改内容为：GB/T24894-2010修订标准101范围本标准规定了动植物油脂中甘三酯分子2-位脂肪酸（B或内位）组分的测定。由于胰脂酶的活性，本方法只适用于熔点45C以下的油脂。本方法不适用于含有下列组分的油脂：含有十二或更少碳原子的脂肪酸（如：椰子油、棕梅仁油、黄油）；含有二十碳或更多碳原子的百度不饱和脂肪酸（多于四个双键）（如：鱼油和海生动物油）；含有氧化次基团的脂肪酸。11范围本文件描述了动植物油脂甘油三酯分子2-位脂肪酸（或内位）组分的测定。本方法使用南极假丝酵母脂肪酶替代原方法中的胰脂酶。本方法适用于熔点低于50的含四碳原子到二十二个碳原子的饱和的和不饱和的脂肪酸的油脂，或在酯交换反应开始后10分钟内在50°C的反应混合物中变成液体的油脂。本方法不适合用于含有下列组分的油脂：含有少于四个碳原子的脂肪酸；含有多于二十二个碳原子的脂肪酸；含有羟基脂肪酸（如：麓麻油酸）。注：双键位置在n-6至n-Il的脂肪酸（如：岩芹酸）被胰脂酶酶解速度非常慢，可能引起错误结果。124.2用于甘油三酯水解的试剂4.2.1 乙醛：不含过氧化物。4.2.2 盐酸：6mol/Lo4.2.3 胆酸钠：1g/L。4.2.4 氯化钙溶液：220g/L（生化试剂）。4.2.5 缓冲溶液：1mol/L三羟甲基氨基甲烷（别名:三羟甲基甲胺、2-氨基2丙基-1,3-二醇）溶液。用盐酸（4.2.2）调节至pH8（用PH计测量）。溶液在（TC4条件F贮存，保存期14天。4.2.6 胰脂酶：活性8单位mg20单位mgo储存在干燥的冰箱里。使用前取出所需粉末状品，使其温度达到室温。注：可使用有良好活性的市售脂肪酶，也可按附录A步骤制备脂肪酶，并检测脂肪酶活性。134.2用于甘油三酯水解的试剂4.2.1 无水乙醇，采用活化分子筛3A脱水72小时以上，含水不超过700mgL°4.2.2 固定化南极假丝酵母脂肪酶（CAL-B）,为一丁名称MOeSZiomyCeSarHarCtiCa（CandidaantarcticatPseudozymaantarcticay。储存在干燥的冰箱里。注：商品化的CAL-B包括：Novozym435（丹麦诺维信），IM-NEloo（无锡蔚蓝生物），LipaseCLtAmano,IM（日本天野），Chirazymel-2C4（瑞士罗氏诊断）或其他同等的CAL-B脂肪醐。PLU（PropylLauraleUnit）是月桂酸丙酯单位，对应于规定的标准条件下1分钟内产生1mol月桂酸丙酯所需的旃活性的量。脂肪醐制剂的活性浓度由制造商说明。5. 2用于甘三酯水解的仪器5.1.1 离心机。522玻璃离心管：IOmL,带有磨口玻利塞。5.2.3 电动振荡器：能使离心管激烈摇动。5.2.4 水浴锅：可恒温控制，温度保持在40±0.55.2.5 注射器：ImL,配有细针头。5.2.6 秒表。5. 2用于甘油三酯水解的仪器5.1.1 玻璃离心管：IOmL,带有磨口玻璃塞。5.1.2 电动振荡器，恒温控制的培养箱或水浴箱，能够保持在3050土0.5,以150180转/分速度振荡。5.1.3 水浴锅：可恒温控制，温度保持在30-50C±0.5°Co5.1.4 磁性搅拌棒，聚四氟乙烯涂层，能够保持在150-180转/分速度搅拌。5.1.5 磁性搅拌盘，能够保持在150180转/分速度搅拌。526玻璃过滤器：烧结玻璃的孔隙为1640m05.2.7 秒表。14 8.4水解甘三酯8. 4水解甘油三酯8.4.1 称取(Mg净化的试样(8.3)置于 Ioml离心管(5.2.2)中。如果室温下试样 不是液体，将离心管置于60C65°C的水浴 锅内，如果试样还不完全液化，继续浸在 水浴中，但不超过10s。从水浴锅中取出离 心管，迅速进行8.4.2到8.4.5步躲操作。8.4.2 向已液化的试样加入已预先称 重的约20 mg脂肪酶(4.2.6)和2mL缓存溶 液(4.2.5)。小心摇动，然后加入0.5mL的 胆酸钠溶液(4.2.3)和0.2mL氯化钙溶液 (4.2.4),盖上盖子小心摇动。这曲操作 步骤应在30s内完成，立即将管子放入 40水浴锅内，保持手摇60 s±2s°8.4.3 从水浴锅中取出离心管，在40 下，用振荡器(5.2.3)剧烈摇动120s±2s°8.4.4 立即加入1 mL盐酸(4.2.2)和 ImL乙醛(4.2.1) o盖上塞子，并用振荡 器(5.2.3)剧烈振摇。8.4.5 离心分离，用注射器(5.2.5)将 有机相转移到试管里。如果在环境温度下 试样是固态，再用ImL乙醛浸取，提取物 合并到试管中。8.4.1 称取0.1g净化的试样(8.3)和1.0 g 无水乙醇(4.2.1)置于(5.2.1)中。如果室温 下试样不是液体，将离心管置于40-5(TC的水浴 锅中，直到变为液体。8.4.2 向己液化的试样加入预先称重的具 有440 PLU活性的固定化CAL-B脂肪酶，盖上塞 子，立即摇匀，垂直放入振荡器中(5.2.2), 在30下，继续以150-180转/分速度的转速振荡 3小时±3分钟。也可以在恒温水浴锅中(5.2.3), 采用磁性搅拌棒(5.2.4)或磁性搅拌盘(5.2.5) 搅拌，搅拌转速设置为150转/分速度，反应温 度保持在30下反应3小时± 3分钟。在起草本标准时，440 PLU固定化CAL-B 相当于44mg Novozym 435 , 44mg IM-NE100或 72mg Chirazyme l-2 C4,或38mg脂肪酹CL ,Amano ' IM。8.4.3 用移液管将产品混合物转移到试管 里。将固定化脂肪酶通过烧结玻璃过滤器 (5.2.6)从混合物中除去。反应混合物可在 -20保存至分析。8.4.4 如果需要，可以缩小反应体系，应于 每克净化的甘油三酯需要4400个月桂酸丙酯单 位(PLU)的固定CAL-B脂肪酶，同时确保在 后续分离2-甘油单酯和制备脂肪酸甲酯有足够 的样品用于分析。2.3因规范性引用文件订制和修订产生的变化如下：GB/T24894-2010的“2规范性引用文件”GB/T5530动植物油脂酸值和酸度测定(GBT5530-2005,ISO660:1996,1DT)GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-2008JSO3696:1987,MoD)GB/TI5687动植物油脂试样的制备(GBT156872008,ISO661:2003,IDT)GB/T17376动植物油脂脂肪酸甲酯制备(GBT17376-2008,ISO5509:2000,1DT)GB/T17377动植物油脂脂肪酸甲酯的气相色谱分析(GB/T17377-2008,ISO5508:1990,IDT)更新为：