无菌检查法及其验证.ppt

无菌检查法概念无菌检查法概念 指用于检查药典要求无菌的药品、医疗指用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。的一种方法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现被微明了供试品在该检验条件下未发现被微生物污染。生物污染。无菌检查法概念无菌检查法概念 无菌检查是通过目检微生物在培养基中无菌检查是通过目检微生物在培养基中的生长来判断结果。的生长来判断结果。无菌检验只能给出该批产品受污染的程无菌检验只能给出该批产品受污染的程度。度。无菌检验合格只能说明被测样品无菌，无菌检验合格只能说明被测样品无菌，不能证明整批样品无菌。不能证明整批样品无菌。无菌检查的设施、环境、人员无菌检查的设施、环境、人员 检查环境应在洁净度检查环境应在洁净度1000010000级下的局部洁级下的局部洁净度净度100100级的单项流空气区域内或级的单项流空气区域内或隔离系隔离系统统中进行，其全过程必须严格遵守无菌中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作。操作。隔离系统按相关的要求进行验证，其内隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。无菌检查的设施、环境、人员无菌检查的设施、环境、人员 规定应定期按规定应定期按医药工业洁净室（区）医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度的验证。的现行国家标准进行洁净度的验证。日常检验还需对试验环境进行监控。日常检验还需对试验环境进行监控。无菌检查的设施、环境、人员无菌检查的设施、环境、人员 无菌检查人员必须具备微生物专业知识，无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。并经过无菌技术的培训。无菌隔离系统无菌隔离系统无菌隔离系统是一个不受外界环境影响的、可进行无菌操作的独无菌隔离系统是一个不受外界环境影响的、可进行无菌操作的独立环境系统。立环境系统。使用隔离系统的优点：它能创造一个持续高效的高度无菌空间使用隔离系统的优点：它能创造一个持续高效的高度无菌空间,保保护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的污染，确保操作环境及实验物品表面能达到无菌要求，防止出现污染，确保操作环境及实验物品表面能达到无菌要求，防止出现假阳性结果假阳性结果,保证保证无菌实验结果的可靠性，从而实现一次检出的要无菌实验结果的可靠性，从而实现一次检出的要求；保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染；放置求；保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染；放置隔离器的环境洁净度不需要特殊要求，移动方便等优点隔离器的环境洁净度不需要特殊要求，移动方便等优点 。HTYHTY无菌隔离系统无菌隔离系统无菌检查用培养基的种类及用途无菌检查用培养基的种类及用途 硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基-培养好氧菌、培养好氧菌、厌氧菌厌氧菌 改良马丁培养基改良马丁培养基-培养真菌及好氧细菌培养真菌及好氧细菌 选择性培养基选择性培养基-按硫乙醇酸盐流体培养按硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂。或表面活性剂。培养基的制备及装量培养基的制备及装量 培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。的符合规定的脱水培养基。硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高度的比硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度不超过培养基深度1/21/2。供试品接种前，培养。供试品接种前，培养基氧化层颜色不得超过培养基深度的基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/51/5，否，否则，须经则，须经100100水浴加热至粉红色消失（不超水浴加热至粉红色消失（不超过过2020分钟），迅速冷却，只限加热一次。分钟），迅速冷却，只限加热一次。培养基的储存培养基的储存 制备好的培养基应该保存在制备好的培养基应该保存在2-252-25、避光的、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在环境，若保存于非密闭容器中，一般在3 3周周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在内使用；若保存于密闭容器中，一般可在1 1年内使用。年内使用。应结合实际情况进行验证，以确定培养基应结合实际情况进行验证，以确定培养基有效期。有效期。培养基的适用性检查培养基的适用性检查 本检查可在供试品的无菌检查前或与供本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。试品的无菌检查同时进行。无菌性检查无菌性检查 重要性：培养基无菌不合格将导致实验重要性：培养基无菌不合格将导致实验的假阳性结果。的假阳性结果。检查：每批培养基随机抽取不少于检查：每批培养基随机抽取不少于5 5支或支或5 5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30-3530-35培养，改良马丁培养基置培养，改良马丁培养基置23-2823-28培养，培养，培养培养1414天，应无菌生长。天，应无菌生长。培养基的适用性检查培养基的适用性检查 灵敏度检查灵敏度检查菌种菌种 硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 生孢梭菌生孢梭菌 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 改良马丁培养基改良马丁培养基 白色念珠菌白色念珠菌 黑曲霉黑曲霉培养基的适用性检查培养基的适用性检查菌种选择的原则菌种选择的原则 代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、标准菌株代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、标准菌株(或该药品中常见的污染菌或该药品中常见的污染菌)。金黄色葡萄球菌（代表革兰氏阳性菌）、铜绿色假单金黄色葡萄球菌（代表革兰氏阳性菌）、铜绿色假单胞菌（代表革兰氏阴性菌）、枯草芽孢杆菌（代表药胞菌（代表革兰氏阴性菌）、枯草芽孢杆菌（代表药品中最常见或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厌氧品中最常见或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厌氧菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉菌）。菌）。菌种的要求：不得超过菌种的要求：不得超过5 5代。采用适宜的菌种保藏方法代。采用适宜的菌种保藏方法保存，以保证菌种的生物学特性。保存，以保证菌种的生物学特性。加菌量加菌量:100cfu100cfu。培养基的适用性检查培养基的适用性检查菌液制备菌液制备 试验菌试验菌 培养基培养基 培养温度培养温度 培养时间培养时间 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 营养肉汤营养肉汤 30-35 18-2430-35 18-24铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 生孢梭菌生孢梭菌 硫乙醇酸盐流体硫乙醇酸盐流体白色念珠球菌白色念珠球菌 改良马丁培养基改良马丁培养基 23-28 24-4823-28 24-48黑曲霉黑曲霉 改良马丁琼脂斜面改良马丁琼脂斜面 5-75-7天天培养基的适用性检查培养基的适用性检查培养基接种培养基接种 试验菌试验菌 培养基培养基 每管装量每管装量 接种管数接种管数 接种量接种量 培养时间培养时间金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌 硫乙醇酸盐硫乙醇酸盐 12 ml 2 12 ml 2 支支 1 ml 31 ml 3天天铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌生孢梭菌 白色念珠球菌白色念珠球菌 改良马丁培养基改良马丁培养基 9 ml 29 ml 2支支 1 ml 51 ml 5天天黑曲霉黑曲霉 其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有 1 1支不接种作为空白支不接种作为空白接种量接种量 100cfu100cfu（不能多）（不能多）培养基的适用性检查培养基的适用性检查结果判断结果判断 空白对照应无菌生长，若加菌的培空白对照应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。灵敏度检查符合规定。试验同时应做空白对照试验同时应做空白对照培养基说明培养基说明 无菌检验培养基所能支持生长的微生物无菌检验培养基所能支持生长的微生物是有限的。是有限的。微生物种类繁多，这些微生物有广泛的微生物种类繁多，这些微生物有广泛的生长要求，如：营养、温度和氧等。生长要求，如：营养、温度和氧等。无菌检验培养基不可能支持所有微生物无菌检验培养基不可能支持所有微生物的生长，选择了支持那些最有可能污染的生长，选择了支持那些最有可能污染药品和在药品中生长的微生物的营养的药品和在药品中生长的微生物的营养的培养基。培养基。供试品的无菌检查法供试品的无菌检查法 无菌检查法包括直接接种法和薄膜过滤法。只无菌检查法包括直接接种法和薄膜过滤法。只要供试品性状允许，要供试品性状允许，应优先采用薄膜过滤法。应优先采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。检验条件应与验证的方法相同。薄膜过滤法可以提高无菌检验的检出率，特别薄膜过滤法可以提高无菌检验的检出率，特别是抑菌性供试品，采用薄膜过滤法可以有效消是抑菌性供试品，采用薄膜过滤法可以有效消除供试品的抑菌性，提高检出率。除供试品的抑菌性，提高检出率。供试品的无菌检查法供试品的无菌检查法-直接接种法直接接种法 样品直接移入无菌培养基中。样品直接移入无菌培养基中。每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的体积不得大于培养基体积的10%10%。同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml15ml，改良马丁培养基每管装量不少于，改良马丁培养基每管装量不少于10ml10ml。培养基的用量和高度同方法验证试验。培养基的用量和高度同方法验证试验。每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。供试品的无菌检查法供试品的无菌检查法-薄膜过滤法薄膜过滤法 原理：薄膜过滤法是将供试品通过滤膜，微生物截留原理：薄膜过滤法是将供试品通过滤膜，微生物截留于滤膜上，若有抑菌作用的药品同时使用冲洗液冲洗于滤膜上，若有抑菌作用的药品同时使用冲洗液冲洗滤膜上残留的供试品（如有残留会抑制微生物生长），滤膜上残留的供试品（如有残留会抑制微生物生长），然后，培养滤膜看其是否有微生物生长。然后，培养滤膜看其是否有微生物生长。选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性，水溶选择滤膜材质时应考虑供试品及其溶剂的特性，水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为张滤膜每次冲洗量为100ml100ml，且冲洗量不超过，且冲洗量不超过1000ml1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。以避免滤膜上的微生物受损伤。过滤器应优先选择过滤器应优先选择封闭式封闭式薄膜过滤），薄膜过滤），也可使用一般也可使用一般薄膜过滤器。滤膜孔径不大于薄膜过滤器。滤膜孔径不大于0.45m0.45m，直径约为，直径约为50mm50mm。供试品的无菌检查法供试品的无菌检查法 检验数量检验数量 指一次检验所用供试品最小包装容器的数指一次检验所用供试品最小包装容器的数量量 采用薄膜过滤法应增加采用薄膜过滤法应增加1/21/2的最小检验数量作为阳性对的最小检验数量作为阳性对照；采用直接接种法应增加供试品无菌检查时每个培照；采用直接接种法应增加供试品无菌检查时每