2024淋球菌感染的实验室诊断方法之初步鉴定和确认鉴定.docx

2024淋球菌感染的实验室诊断方法之初步鉴定和确认鉴定1 .淋球菌的初步鉴定1.1 菌落特征选择性培养基上分离出的淋球菌菌落大小及形态随培养基及培养时间的不同可有差异。一般而言，在TM平皿上生长24h后直径大约为0.5mm1mm,呈圆形、凸起、湿润、光滑、半透明或灰白色菌落，通常有黏性。培养48h后菌落直径可达3mm,边缘平滑或呈锯齿状，表面粗糙。1.2 氧化酶试验淋球菌具有氧化酶，能将氧化酶试剂氧化成醍类化合物，出现颜色反应。鉴定事项如下：1.2.1 试剂：包括盐酸四甲基对苯二胺及盐酸二甲基对苯二胺，前者更敏感，工作液为0.5%1%水溶液。1.2.2 方法：将氧化酶试剂滴加于可疑菌落上，观察颜色变化。也可先将试剂滴在一小张滤纸上，然后用白金耳或塑料接种环（含铁接种环可与氧化酶试剂发生反应，产生假阳性）挑取可疑菌落与之接触；或先将菌落涂在滤纸上，再滴加试剂，观察有无颜色变化。1.2.3 结果：在10s15s内出现深紫红色（二甲基对苯二胺）或深紫兰色（四甲基对苯二胺）即为阳性反应。1.2.4 注意事项：氧化酶试剂对细胞有毒性，可迅速杀死淋球菌。因此，需保留菌株时应注意不要将试剂滴于全部可疑菌落上，留一部分菌落做传代培养。1.2.5 临床意义：淋球菌氧化酶试验为阳性，但氧化酶反应并非特异性试验。所有奈瑟菌属细菌及许多其他细菌包括多数弧菌、布氏菌属、绿脓杆菌及嗜血杆菌属等氧化酶反应亦呈阳性。如氧化酶阴性，一般可排除淋球菌。1.3 革兰染色取单个可疑菌落制备涂片做革兰染色，在油镜下检查。24h的新鲜菌落可见到呈典型肾形的革兰阴性双球菌（约占25%）,其余呈单球、四联或八叠形。超过48h的较老培养物，因细菌自溶，革兰染色常难以说明问题。2 .淋球菌的确认鉴定2.1 注意事项对于取自泌尿生殖道的标本，在选择性培养基上分离出氧化酶阳性的革兰阴性双球菌一般可诊断为淋球菌，准确率98%。但对取自泌尿生殖道以外部位的标本，来自低危人群如儿童的分离株，以及涉及医疗法律案例的分离株，应对培养的菌株经糖发酵试验进一步鉴定确证。2.2 糖发酵试验该试验检测奈瑟球菌分解特定糖类（葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖）而产酸的能力。根据淋球菌仅分解葡萄糖,脑膜炎球菌分解葡萄糖和麦芽糖等可将淋球菌与其他奈瑟球菌加以鉴别。鉴定事项如下：2.2.1 试齐IJ:配制20%的葡萄糖、麦芽糖、孚廉及蔗糖,过滤除菌。配制缓冲平衡盐指示溶液（BSS）:每1L中含磷酸氢二钾（K2HPO4）0.4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）0.1g、氯化钾（KeI）8.0g、酚红0.6g、pH7.1pH7.2。过滤除菌，贮于4。C备用。2.2.2 方法：WHO推荐的微量试管法，步骤如下：D取在非选择性（不含抗生素）巧克力琼脂或血液琼脂培养基上过夜生长的纯培养淋球菌（2接种环），在0.4mLBSS中制成浓厚菌悬液；2）取5支小试管，在1管4管中分别加入20%过滤除菌的葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖各0.05mLo第5管不加糖，作为阴性对照管；3）每管加入0.1mLBSS;4）每管加0.05mL菌悬液，充分混匀，置37。C水浴箱中孵育4h,观察结果。2.2.3 结果观察：淋球菌仅发酵葡萄糖，不发酵其他糖类。仅葡萄糖管颜色由红变为黄色，为淋球菌。2.2.4 注意事项:用于试验的糖类纯度要高,尤其是麦芽糖应为分析纯级。糖发酵试验中常因杂菌污染导致假阳性反应或培养物过老自溶而导致假阴性反应。因此，待测菌应为纯培养物，不能用选择性培养基上的初代分离菌（可能含有杂菌此外,菌悬液浓度要足够高。每批试验应有WHO或ATCC标准菌株做质控。2.2.5 临床意义：选择性培养基上分离出的氧化酶阳性、革兰阴性的双球菌，若糖发酵试验阳性可确定为淋球菌。糖发酵试验的特异性为99%100%,某些淋球菌菌株尤其是AHU-分离株反应弱，可呈现阴性葡萄糖反应，需用另外的试验加以鉴定。麦芽糖阴性的脑膜炎球菌也会被误鉴定为淋球菌，对泌尿生殖道外的分离株最好采用一种以上的鉴定方法。