牙膏中耐热大肠菌群检验方法.docx
牙膏中耐热大肠菌群检验方法DetectionofThermotolerantColiformBacteriainToothpaste1范围本规范规定了牙膏中耐热大肠菌群的检验方法。本规范适用于牙膏中耐热大肠菌群的检验。2定义2.1耐热大肠菌群Thermotoleranlcoliformbacteria系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在44.5C培养24h48h能发酵乳糖产酸并产气。该菌主要来自人和温血动物粪便，可作为粪便污染指标来评价牙膏的卫生质量，推断牙膏中有否污染肠道致病菌的可能。3仪器3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44.5C÷0.5°Co3.2 温度计03.3 显微镜。3.4 载玻片。3.5 接种环。3.6 电磁炉。3.7 三角瓶：250mL。3.8 试管：18mmxl50mm03.9 小倒管。3.10 PH计或PH试纸。3.11 高压灭菌器。3.12 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、IOmL（具0.1mL刻度）或者移液器及吸头。3.13 灭菌平皿：直径90mm。4培养基和试剂见总则3.1。4.2 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基成分：蛋白腺40g猪胆盐10g乳糖10g0.4%溟甲酚紫水溶液5mL卵磷脂2g吐温8014g蒸储水IooOmL制法：将卵磷脂、吐温80溶解到少量蒸储水中。将蛋白陈、胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馅水中，加到一起混匀，调PH为7.4,加入0.4%澳甲酚紫水溶液，混匀，分装试管，每管IOmL（每支试管中加一个小倒管）。115°C高压灭菌20min。4.3 伊红美蓝（EMB）琼脂成分：蛋白陈IOg乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20g2%伊红水溶液20mL0.5%美蓝水溶液13mL蒸储水IOoomL制法：先将琼脂加到90OmL蒸储水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾和蛋白陈，混匀，使之溶解。再以蒸储水补足至100omJ调PH值为7.27.4,分装于三角瓶内，121高压灭菌15min备用。使用前将琼脂融化，于每IoOmL琼脂中无菌操作加入5mL灭菌的20%乳糖溶液、2mL2%伊红水溶液和1.3mL0.5%美蓝水溶液，摇匀，冷至45C5（C,倾注平皿备用。4.4 蛋白陈水（靛基质试验用）成分：蛋白豚（或胰蛋白陈）20g氯化钠5g蒸储水1000mL制法：将上述成分加热融化，调PH值为7.07.2,分装小试管，I21C高压灭菌15min。4.5 靛基质试剂柯凡克试剂:将5g对二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醉中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。试验方法：接种细菌于蛋白陈水中，于44.5±0.5培养24h±2h°沿管壁加柯凡克试齐IJ0.3mL0.5mL,轻摇试管。阳性者于试剂层显深玫瑰红色。注:蛋白陈应含有丰富的色氨酸,每批蛋白陈买来后,应先用己知菌种鉴定后方可使用。1.1 .1染液制备4.6 .Ll结晶紫染色液：结晶紫1g95%乙醇20mL1 %草酸镂水溶液80mL将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸镂溶液混合。1.1.1.2 革兰氏碘液：碘1g碘化钾2g蒸溜水加至300mL将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馅水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸储水至300mLo1.1.1.3 脱色液：95%乙静。1.1.1.4 免染液：（1）沙黄复染液：沙黄0.25g95%乙醇IOmL蒸谣水90mL将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸储水稀释。（2）稀石碳酸复红液：称取碱性复红10g,研细，加95%乙醇IOomL,放置过夜，滤纸过滤。取该液10mL,加5%石碳酸水溶液90mL混合，即为石碳酸复红液。再取此液IomL加水90mL,即为稀石碳酸复红液。4.6.2 染色法4.6.2.1 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染Imin,水洗。4.6.2.2 滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗。4.6.2.3 滴加95%乙醇脱色，约30s,或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s,水洗。4.6.2.4 滴加复染液，复染Imin,水洗，待干，镜检。4.6.3 染色结果革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。注：如用1:10稀释石碳酸复红染色液作复染，复染时间仅需10s。5操作步骤5.1 取IOmL1:10的检液,加到IomL双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置44.5°C±0.5°C培养箱中培养24h±2h,如既不产酸也不产气，继续培养至48h±2h,如仍既不产酸也不产气，则报告为耐热大肠菌群阴性。5.2 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36C±1C培养18h24h°同时取该培养液12滴接种到蛋白陈水中，置44.5±0.5培养24h±2h.经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。耐热大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽；或粉紫色、中心较深的菌落，亦常为耐热大肠菌群，应注意挑选。5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。5.4 在蛋白陈水培养液中，加入靛基质试剂约0.5mL,观察靛基质反应。阳性反应液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。5.5 如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统，可从营养琼脂平板上挑取经纯化的可疑菌落，用无菌稀释液制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。6检验结果报告经上述检验步骤，若发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性无芽胞短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出耐热大肠菌群。
