Akkermansia muciniphila在肠道消化模拟系统中的变化与意义.docx

Akkermansiamuciniphila定植在人类肠道黏液层，是可特异性降解黏蛋白的革兰氏阴性严格厌氧菌。Amuciniphila作为偏好定植在肠道黏液层中的细菌，既降解黏蛋白维持自身丰度，又刺激机体黏液层增厚，维持机体健康状况。有报道发现A.muciniphila的丰度在患肠道紊乱或某类疾病的人群中较低，其定植情况是机体健康水平的标志之一。越来越多的研究证明A.muciniphila在人体肠道中具有重要的功能性，但是有部分人群肠道中A.muciniphila的丰度可能较低，甚至没有定植。因地域不同，人群居住的环境和饮食结构存在差异，可能对A.muciniphila定植率存在影响。根据以上研究成果，提出对应的假设：中国人群的A.muciniphila定植率可能低于国外人群，因此需要通过一些方式去改变现状。通过收集地区健康的成年人体粪便，分析A.muciniphila的定植情况；将团队设计的符合东方人饮食习惯的人体胃肠道微生态消化做拟系统为研究基础，选择3个无A.muciniphila定植的志愿者粪便为接种物，进行IX108CFUmL丰度的A.muciniphila干预，通过宏基因组测序技术联合实时聚合酶链式反应(real-timePCR)系统研究A.muciniphila的干预所引起的肠道菌群变化。A.muciniphila定植情况分析经过real-timePCR分析，在131人中有117人A.muciniphila定植阳性，定植率为89.31%,A.muciniphila定植平均丰度为5.825(Ig(CFUZmD)o菌属的real-timePCR标准曲线总菌属标准曲线的菌落计数为4.52xlO9CFUmL,扩增效率为92.039%,标准曲线拟合度R2为0.999；Bifidobacterium标准曲线的菌落计数为2.56×108CFUmL,扩增效率为90.509%,标准曲线拟合度R2为0.991；Lactobacillus标准曲线的菌落计数为4.74×109CFUmL,扩增效率为97.251%,标准曲线拟合度R2为0.995；Bacteroides标准曲线的菌落计数为5.645×108CFUmL,扩增效率为105.919%,标准曲线拟合度R2为0.997；AkkermanSia标准曲线的菌落计数为3.84xlO8CFUmL,扩增效率为94.859%,标准曲线拟合度R2为1.0,所有菌属系数均为合理范围内，具有定量意义。不同菌属real-timePCR定量结果结果显示，与接种液中的总菌属比较，所有组的总菌属在14h后丰度呈现显著性下降，说明营养物质开始出现不足。对照组的A.muciniphila未检测出，说明志愿者的粪便中不含A.muciniphila定植，即使在检测限外的丰度也不会出现大量增长；实验组(Al、A2)的A.muciniphila在14h前保持初始的高丰度(7(lg(CFUZmD)以上),以及出现少量增长，说明A.muciniphila可以在肠道菌群环境中维持生长。实验组(Al、A2)的BaCterOideS属与BifidobaCteriUm属丰度均不断下降，说明A.muciniphila的加入可能增加了两者的生存压力；对照组的Bifidobacterium属的丰度出现波动性上升，说明无A.muciniphila的存在对其生长抑制性较小。在14h前，实验组的LaCtobaCilIUS属的丰度均出现上升，但对照组的丰度降低，说明A.muciniphila可能对Lactobacillus属具有促进生长的作用。发酵液16SrDNA测序分析y 7 yEscherichia Shigclla Dialixter Bactcmidcs EntcrtKiHCUs PrGOfdIa 9AlloprexotellaSuMohranuhtmLachwspiraLck hntjspir(K eae NK4136 group r.<ar-J LiK <jwj SyiterclfaEulvnufn nufunantiuni gnp lii/iJobactcrmm .RuiuMMKuccacvac UCG 002RUmnXKPCeUWaC UCG 013ParabactcroidesSfeptuciKCUSClostndium SenSU Stricto 1Lac IuhiKiIIits i ahb(icumRiifiHnococcaccac NK4A2I4 groupAlistpLaChnod"3lrUh"mCllinella Lad(Hwcu Flaonifntr ROmhOMHa OiknihiHier AIhSneHu Haenuhilus HoldemanellaOOO0.010.153.6295.93超府王国/%由样本菌属水平分析（图2）可知，实验组的BaCterOideS属均总体呈现下降的趋势，对照组的24h的Bacteroides呈现小幅上升，结果与real-timePCR的分析相匹配；24h,实验组AI和A2的Lactobacillus属丰度比对照组要高，而Bifidobacterium属要低于对照组，整体趋势与real-timePCR的分析相似。 EnteroctHCUxJaetatis Streifloct'<usallo/viicnsuhsp.nta<'c<hnicu uniucnli11(xl 1.aiiobadHuvaginalis OscillospiraceacBacternimVE2O2_24LavloccKrcusIaU认 1.uitobiKiHusjohnonii“humangutmeagenon ClomdiumIeptum 1.achnospiraceaebacteum615 BikiIIussubfHis组别M一,一？ Ul如图3所不，实验组AI和A2的菌种变化情况总体相同，说明测序结果平行性较好，其主要变化趋势为：发酵2、14h和24h,BaCiIhlSSUbtiliS相对丰度持续降低；两组Lactobacilluslactis相对丰度总体呈现增长；OscillospiraceaebacteriumVE202_24相对丰度均大量下降；Streptococcusgallolyticussubsp.macedonicus相对丰度均持续增长；1.achnospiraceaebacteriumb15相对丰度较为稳定。对照组S.gallolyticussubsp.macedonicus相对丰度在2h和14h呈现大量增长后，24h降低至I低于2h；L.vaginalisLJactis和Ljohnsonii均在小幅增长后，大量降低；OSCiIlOSPiraCeaebaCteriUmVE202_24相对丰度显著下降；Enterococcusfaecalis持续增长，成为相对丰度最高的菌属。实验组与对照组的对比可知，A.muciniphila加入到稳定的肠道微生态中，主要使L.vaginalis>LJactis和Ljohnsonii呈现增殖，趋势与real-timePCR的检测结果匹配。对照组因为无明显优势菌群的存在，可能使容易生存的菌种生长较快，如E.faecalis和S.gallolyticus,让营养来源单一的菌种逐渐衰亡，如OscillospiraceaebacteriumVE202_24oOscillospiraceaebacterium主要吸收宿主聚糖存活，而发酵液中的关键营养成分为MUCin,结构中有大部分为聚糖，但因A.muciniphila的干预使黏蛋白大量消耗，因此可能使这类菌种营养物质匮乏。主坐标分析从图4可知，按照时间点分组，2、14h和24h的空间距离较大，显示样本群的差异较大；按照实验组和对照组分析，组间距离较小，相同时间点的样本聚在一起，显示其差异较小。因此在菌落总体结构上，A.muciniphila添加后对肠道微生态的结构无显著影响，说明其对肠道菌群组成没有破坏性。结论与讨论在地区人群的A.muciniphila定植率为89.31%,平均丰度为5.825(Ig(CFUmL)o肠道消化模拟不同时间点的real-timePCR结果显示，A.muciniphila在模拟人类肠道微生物菌群环境中具备生存能力；对Bifidobacterium属和BaCteroideS属具有抑制效果，对LaCtObaCilhIS属具有促进作用。16SrDNA基因组测序结果显示：实验组L.lactis、S.gallolyticussubsp.macedonicus相对丰度均呈现增长，OscillospiraceaebacteriumVE202-24相对丰度大幅降低，Lachnospiraceaebacterium615相对丰度较为稳定；在菌落总体结构上，A.muciniphila添加后对肠道微生物菌群的结构无显著影响，说明其对肠道菌群组成没有破坏性。本研究选择无A.muciniphila定植的肠道菌群作为接种液，再添加一定丰度的A.muciniphila活菌进行干预，但有报道表明1%5%为接近最健康人群的丰度。这是本研究疏漏的一个需要探究的点，未来将进行改进。本研究采用时长为24h的肠道消化模拟系统，仅能作为参考评估A.muciniphila对肠道菌群的作用。今后应设置长时间段的评估实验,其中包括35d的菌群稳定期和7d以上的长期定植评估等。本研究中，A.muciniphila添加到新的肠道微生物菌群中，可能增加了营养物质的消耗，尤其是黏蛋白的利用，使需要黏蛋白作为能源的菌群生长受到抑制。在14h后总菌数出现大幅下降，说明营养物质开始缺乏，使营养要求不高的肠道菌群丰度出现额外的增长，生存竞争能力较强；16SrDNA基因组测序结果显示14h后ESCheriChiaShigeIla属出现明显增长，可能对其他菌属有限制或竞争作用，影响菌群的结构组成。但由总体菌落结构可知，Amuciniphila的添加对肠道微生物菌群的结构无显著性破坏作用，表明其可能具备活菌摄入的基本要求。对于低丰度或无A.muciniphila定植的人群，需找出对应的合理方式帮助A.muciniphila定植或者大量增-良。利用体外肠道消化系统探究A.muciniphila在肠道中初次定植更具有参考价值。本研究完成A.muciniphila在人体肠道微生态的变化评估，还需对体内进一步深入研究，因此将此类肠道微生态移殖到无菌动物模型中，再摄入A.muciniphila活菌可能更具合理性，这也是本团队后续的研究工作之一。肠道重要菌属AkkermansiaMuciniphila,它如何保护肠道健康嗜粘蛋白-阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila,A.muciniphila),简称为AKK,于2004年发现，是一种从人类粪便中分离出来的椭圆形革兰氏阴性细菌。该细菌以荷兰微生物生态学家AntonDLAkkennans的名字命名，以表彰他对该领域的贡献。A.muciniphila是人类肠道共生菌，并可以依靠肠粘液层的黏蛋白生存。在过去十年中，越来越多的研究证明，在糖尿病、心血管疾病、疾病性肠病、神经疾病发现A.muciniphila丰度降低。最近的干预研究还证实如茶或富含多酚水果的饮食可增加其丰度，有助于改善糖尿病和肥胖个体的代谢功能。总的来说，来自动物和人类研究的越来越多的证据表明A.muciniphila将成为下一代有临床应用前景的益生菌。尤其是它在预防和治疗糖尿病、肥胖症及癌症，这对未来的研究具有重要意义和发展。Ol什么是Akker