单胺氧化酶（MonoamineOxidaseMAO）试剂盒使用方法.docx
单胺氧化酶(MonoamineOxidase,MAO)试剂盒使用方法单胺氧化酶(MonoamineOxidase,MAO)试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择23个预期差别大的样本做猜测定。测定意义：MAO(EC1.4.3.4)重要存在于脊椎动物的各种器官，特别是分泌腺、脑、肝脏，在无脊椎动物、豆类的芽等植物中也存在催化单胺类物质代谢，含量较低，具有紧要的生理功能，其活性能反映肝纤维化的程度。另外，MAO活性异常导致细胞内单胺类神经递质运转显现紊乱，从而引发多种病症。测定原理：MAO催化单胺类底物脱氨生成相应的醛，进一步氧化成酸；底物在36Onln处有特征汲取峰，测定36OnnI光汲取下降的速率，计算MAO活性。自备试验用品及仪器：天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸储水。试剂构成和配制：提取液一：液体IoonIL义1瓶，4保管。提取液二：液体IoomLXl瓶，4。C保管。试剂一：液体12OnILXI瓶，4保管。试剂二：液体2mLXl管，4。C避光保管。粗酶液提取：1 .称取约Slg样品，加InIL预冷的提取液一充分冰浴匀浆，100Og,4,离心IOnIin,弃沉淀；把上清转移到另一预冷的离心管，10000g,4,离心30min,弃上清；加入InIL预冷的提取液二，震荡混匀，16000g,4,离心40min,弃上清；沉淀加入预冷的ImL试剂一，震荡混匀，即粗酶液（可用于可溶性蛋白浓度测定）。2 .细菌、真菌：依照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为5001000：1的比例（建议500万细胞加入InlL提取液），冰浴超声波碎裂细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后IoOO0g,4,离心IOmin,弃沉淀；把上清转移到另一预冷的离心管，10000g,4,离心30min,弃上清；加入LOnIL预冷的提取液二，震荡混匀，16000g,4,离心40min,弃上清；沉淀加入预冷的LOmL试剂一，震荡混匀，即粗酶液（可用于可溶性蛋白浓度测定），取上清置于冰上待测。3.血清：直接测定Q测定操作表：1、分光光度计/酶标仪预热30min,调整波长至360nm02、操作表对照管测定管酶液（L）20试剂一（L）180160试剂二（L）2020混匀，于微量石英比色皿/96孔板，对照管调零，测定36Onm处吸光值Al,然后37。C水浴60min,对照管调零，测定36Onm处吸光值A2、AA=AlA2注意：空白管只需测定一次。MAO活性计算公式:a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、按蛋白含量计算酶活定义：37,pH7.6时，每毫克蛋白质InIin内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。DAO活性（nmol/min/mgprot）=XV反总÷（V样XCpr）÷T=114×A÷Cpr2、按样本质量计算：酶活定义：37,pH7.6时，每克样品Imin内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。DAo活性（nmol/min/g鲜重）=XV反总÷（V样÷V样总XW）÷T=114×A÷W3、依照细胞数量计算酶活定义：37,pH7.6时，每104个细胞Imin内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。DAO活性(nmol/min/104cell)=XV反总÷(V样÷V样总X细胞数量)÷T=114×AA÷细胞数量4、依照液体体积计算酶活定义：37,pH7.6时，每升血清Imin内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。DAO活性(nmol/minL)=XV反总÷V样=114XA:底物摩尔消光系数，1460Lmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，60min,W：样本质量，gb.用96孔板测定的计算公式如下1、按蛋白含量计算酶活定义：37,pH7.6时，每毫克蛋白质Imin内转化1nmol底物的酶量为一个酶活单位。DAO活性（nmol/min/mgprot）=XV反总÷（V样XCpr）÷T=228×A÷Cpr2、按样本质量计算：酶活定义：37,pH7.6时，每克样品InIin内转化Inmc）I底物的酶量为一个酶活单位。DAo活性（nmol/min/g鲜重）=XV反总÷（V样÷V样总XW）÷T=228×A÷W3、依照细胞数量计算酶活定义：37,pH7.6时，每104个细胞Imin内转化IninOl底物的酶量为一个酶活单位。DAO活性（nmol/min/104cell）=XV反总÷（V样÷V样总X细胞数量）÷=228×AA÷细胞数量4、依照液体体积计算酶活定义：37,pH7.6时，每升血清Imin内转化IrImoI底物的酶量为一个酶活单位。DAo活性（nmol/min/L）二XV反总÷V样二228000义AA：底物摩尔消光系数，1460Lmol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应总体积，0.2mL；V样：反应中样本体积，O.02mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，60min,W：样本质量，g注意事项：1、吸光度变动应当掌控在0.010.8之间。否则加大样品量或稀释样品，注意计算公式中参加计算的稀释倍数要相应转变。2、样品蛋白质含量需要另外测定。
